產(chǎn)品介紹 

EasyFusion Assembly Master Mix 是一種快速、簡(jiǎn)單且高效的定向同源重組克隆試劑盒，可將目的片段一個(gè)或多個(gè) （PCR 產(chǎn)物）定向克隆到任意載體的任意位置。該技術(shù)不依賴于 T4 連接酶、不受載體和目的片段的酶切位點(diǎn)限制， 僅需 15-30 分鐘實(shí)現(xiàn)高效無縫連接。 

操作步驟

1.線性化載體準(zhǔn)備 

可以通過以下兩種方法獲得線性化載體，最終載體的濃度需>10 ng/μl。(高濃度的載體有利于提高效率)。

（1）選擇合適的酶切位點(diǎn)線性化載體。（單酶切或雙酶切均可， 5′端突出、3′端突出或平末端均適用）

（2）以載體為模板，設(shè)計(jì)引物，通過 PCR 的方式擴(kuò)增出需要的線性化載體 

2.擴(kuò)增插入片段引物設(shè)計(jì) 

通常通過 PCR 獲得目的片段，引物設(shè)計(jì)要保證目的片段兩端有至少 15bp-20bp 序列與線性化載體的兩端一致的 同源序列。PCR 每條引物長度至少在 35-40bp 之間，包括 5′ 端和 3′端與線性載體同源的 15bp-20bp（不包括酶 切位點(diǎn)）以及目的片段特異性序列 20-25bp。

（1）單個(gè)片段的引物設(shè)計(jì)：

引物包含目的基因特異性序列和重疊序列 插入片段正向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式為： 5′-上游載體末端 15-20bp 同源序列+目的基因特異性正向擴(kuò)增引物序列(20-25bp)-3′ 插入片段反向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式為： 5′-下游載體末端 15-20bp 同源序列+目的基因特異性正向擴(kuò)增引物序列(20-25bp)-3′ 設(shè)計(jì)引物時(shí)，可以參考以下實(shí)例（以 pUC19 線性化載體為例）：

3.PCR 擴(kuò)增插入片段

推薦使用高保真聚合酶進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增插入片段，以減少擴(kuò)增突變的產(chǎn)生，選擇聚合酶時(shí)無需考慮末端有無 A 加尾 發(fā)生（重組過程中將會(huì)被去除，在最終載體中不會(huì)出現(xiàn)）。PCR 擴(kuò)增結(jié)束后，對(duì)目的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化：若是擴(kuò)增模 板與克隆載體抗性不同，且 PCR 產(chǎn)物條帶電泳單一，產(chǎn)物可以無需純化直接用于重組反應(yīng)，或者對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽 等簡(jiǎn)單純化；否則，需要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收特異性的目的 PCR 片段。 4.重組反應(yīng)進(jìn)行 取出 EasyFusion Assembly Master mix, 置于冰浴中，配制下圖應(yīng)體系（如果不慎將液體粘在管壁，可通過短暫離心沉降）

注意：10 ul 反應(yīng)體系中，載體和各插入片段建議量在 20-50ng 之間，載體與各插入片段的最佳摩爾比為 1:2-1:3 

輕輕混勻反應(yīng)體系，50℃反應(yīng) 15-30 分鐘（對(duì)于多片段重組或大片段重組，建議反應(yīng)時(shí)間 30 分鐘，可延長反應(yīng)時(shí) 間至 1 小時(shí)）；待反應(yīng)結(jié)束后，將離心管置于冰上冷卻數(shù)秒，之后將重組產(chǎn)物保存于-20℃或用于轉(zhuǎn)化。 

5. 反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、涂板及克隆鑒定 建議所使用的感受態(tài)細(xì)胞效率要達(dá)到> 5X 107 cfu/ug。轉(zhuǎn)化步驟按照不同菌種的要求進(jìn)行或者按標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化操作 進(jìn)行即可。菌落長出之后，建議采用菌落 PCR 進(jìn)行陽性克隆鑒定，或者對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)序確保正確。

保存條件及組成成分 

-20℃保存及冰袋運(yùn)輸 組成成分：2X EasyFusion Assembly Master Mix , 125ul; Linearized pUC19 Vector (10ng/ul),5ul;Control Insert（0.5kb, 20ng/ul),5ul

注意事項(xiàng) 

1. 線性化載體或目的片段的純化的品質(zhì)及濃度等較差會(huì)顯著降低克隆陽性率及克隆數(shù)。

2. 重組質(zhì)粒大小的增加（>12kb），克隆效率會(huì)顯著降低，選擇穩(wěn)定性更好的感受態(tài)及轉(zhuǎn)化效率更高效的感受態(tài)細(xì)胞。

3. 菌落較少時(shí)，建議適當(dāng)增加重組反應(yīng)產(chǎn)物的體積量，或者提高轉(zhuǎn)化產(chǎn)物量等。

4. 隨著重組片段數(shù)目的增加，克隆效率降低，建議增加引物重疊序列長度或適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間。