產(chǎn)品介紹 

新賽美生物生產(chǎn)的蛋白裂解及上樣緩沖液(ProtLytic Protein Lysis and Sample Loading，1X)，是一種經(jīng)過改良的以溴酚藍(lán)為染料 的可直接裂解蛋白且直接上樣的緩沖液?？梢灾苯佑糜诩?xì)胞或組織樣品的裂解，并用于后續(xù)常規(guī)的 SDS-PAGE 蛋白樣品的上樣。 直接裂解蛋白樣品的優(yōu)點(diǎn)是比較便捷；缺點(diǎn)是裂解好的蛋白樣品不能用常規(guī)的 Bradford 法或 BCA 法測定蛋白濃度。這樣蛋白 上樣量的均一性就較難控制，需要借助考馬斯亮藍(lán)等的染色結(jié)果或 Western 的檢測結(jié)果，來調(diào)整上樣量。該產(chǎn)品是還原性的， 加入了 TCEP 的還原劑，替代了傳統(tǒng)的 DTT 或 2-ME，還原劑 TCEP 無難聞氣味，穩(wěn)定性更高，還原效果更佳 。

操作步驟

1. 取適當(dāng)量的蛋白裂解及上樣緩沖液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入 PMSF，使 PMSF 的最終濃度為 1mM。 

注意：該產(chǎn)品不含蛋白酶等抑制劑，根據(jù)需要在使用前添加蛋白酶，磷酸酶等抑制劑（蛋白酶抑制劑混合液,貨號：P001）。 

2.對于貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用 PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗)。按照 6 孔板每孔 加入 150-250 微升比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。 

3. 對于懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，將細(xì)胞用力彈散。按照 6 孔板每孔細(xì)胞加入 150-250 微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕 彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多，必需分裝成 50-100 萬細(xì)胞/管，然后再裂解。 對于組織樣品： (a). 把組織剪切成細(xì)小的碎片。 (b) 按照每 20 毫克組織加入 150-250 微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度 的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量)  (c) 用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。充分裂解后，將樣品收集到一潔凈離心管中。

4. 100℃或沸水浴加熱 5-10 分鐘，以充分變性蛋白。 

注意：煮沸前通常會發(fā)現(xiàn)蛋白樣品內(nèi)有粘稠的半透明狀物體，通常在本上樣緩沖液內(nèi)沸水浴煮沸 8-10 分鐘后可以確保該粘稠的 半透明狀物體消失，以便于后續(xù)的上樣操作。 

5.冷卻到室溫后，室溫稍離心一下以沉淀可能出現(xiàn)的雜質(zhì)等，上清即可直接上樣到 SDS-PAGE 膠加樣孔內(nèi)即可。通常電泳至藍(lán)色染料 到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。 

注意事項(xiàng)：

1. 裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團(tuán)膠狀物，屬正常現(xiàn)象。

2．為獲得最佳的實(shí)驗(yàn)效果，可適當(dāng)分裝使用，以盡量避免反復(fù)凍融。

3．PMSF 應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)加,需自備 PMSF。

4．裂解蛋白的所有步驟都需在冰上或 4℃進(jìn)行。

5．蛋白酶抑制劑均有較高的毒性，為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。一旦直接接觸，請立即用流水沖洗， 再向醫(yī)療保健結(jié)構(gòu)咨詢