產(chǎn)品介紹

Cell Counting Kit-8簡稱CCK-8試劑盒，是MTT，XTT等的替代方法，一種基于WST-8（水溶性四唑鹽，化學名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。CCK-8溶液可以直接加入到細胞樣品中，不需要預配各種成分。WST-8在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成橙黃色的Formazan。對于同樣的細胞，顏色的深淺(生成的Formazan量)和細胞數(shù)目呈線性關系?？捎糜谒幬锖Y選、細胞增殖和毒性測定、腫瘤藥敏等試驗。

操作步驟

一. 制作標準曲線（測定細胞具體數(shù)量）

1.先用細胞計數(shù)板計數(shù)所制備的細胞懸液中的細胞數(shù)量，然后接種細胞；

2.按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做4-7個細胞濃度梯度，每組3-6個復孔；

3.接種后培養(yǎng)2-4小時使細胞貼壁，然后加入CCK-8試劑（按每100 μL培養(yǎng)基加10μL CCK-8）培養(yǎng)一定時間后測定OD值，制作出一條以細胞數(shù)量為橫坐標，OD值為縱坐標的標準曲線。根據(jù)此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數(shù)量。（使用此標準曲線的前提條件是試驗條件完全一致）

二. 細胞活性檢測

1.在96孔板中接種細胞懸液(100μL/孔)，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)一段時間；

2.向每孔加入10μL的CCK-8溶液(注意不要產(chǎn)生氣泡，它們會影響OD值的讀數(shù))；

3.將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內孵育1-4小時；

4.用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

三.細胞增殖-毒性檢測

1.在96孔板中接種細胞懸液(100μL/孔)，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24小時；

2.向培養(yǎng)板加入不同濃度的待測藥物；

3.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當?shù)臅r間；

4.向每孔加入10μL的CCK-8溶液(注意不要產(chǎn)生氣泡)；

5.將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內孵育1-4小時；

6.用酶標儀測定在 450 nm 處的吸光度。 

注意：如果待測物質有氧化性或還原性的話，可在加 CCK-8 之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次， 然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。

四.活力計算

細胞存活率*（%）=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%

抑制率*（%）=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%

As:實驗孔吸光度(含細胞、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液和藥物溶液)；

Ac: 對照孔吸光度 (含細胞、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，不含藥物) ；

Ab: 空白孔吸光度 (含培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，不含細胞、藥物) 。

保存條件

4℃避光保存，有效期12個月；-20℃避光保存，有效期24個月

實驗應用

1. 細胞增殖測定：CCK-8是水溶性的，在培養(yǎng)基中穩(wěn)定且無毒。

2. 細胞活性分析，包括細胞毒性：代謝活性以及染料的形成與細胞的活性和損傷成比例。

3. 細胞因子分析：測定細胞因子誘導的增殖，必要時，可在試驗結束時回收和擴增細胞

注意事項

1.CCK-8的培養(yǎng)時間一般為1-4小時，但在培養(yǎng)30分鐘左右即可取出肉眼觀察顯色程度，根據(jù)細胞種類而定，需要摸索條件，CCK-8的最佳反應時間以具體顯色的最佳時間為準。

2.使用96孔板進行檢測時，如果細胞培養(yǎng)時間較長，一定要注意蒸發(fā)問 題。一方面，由于96孔板周圍一圈最容易蒸發(fā)，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加相同量的PBS,水或培養(yǎng)液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培養(yǎng)箱內水源的地方，以緩解蒸發(fā)。

3.本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應，所以還原劑 (例如一些抗氧化劑)會干擾檢測，如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設法去除。用酶標儀檢測前需確保每個孔內沒有氣泡，否則會干擾測定。

4.加入藥物中如含有金屬，對 CCK-8 顯色有影響。終濃度為1mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%,15%,90% 的顯色反應，使靈敏度降低。如果終濃度是10mM的話，將會100% 抑制。

5.培養(yǎng)基中的酚紅不會影響實驗結果，酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。

6.本產(chǎn)品可以檢測革蘭氏陰性細菌，但不能檢測革蘭氏陽性細菌和酵母細胞。向100μL培養(yǎng)液中加入10μL CCK-8溶液，并培養(yǎng)1-4小時或過夜。

7.CCK-8試劑對細胞的毒性非常低。它和活細胞內的脫氫酶持續(xù)反應使溶液顏色不斷加深，OD值不斷增加(注: 活細胞內的脫氫酶是持續(xù)產(chǎn)生的)。

8.要測定細胞的具體數(shù)量，建議同時做標準曲線。

9.建議采用多通道移液器，以減小平行孔間的差異。

10.以下方法可以終止CCK-8反應(96 孔板)：(a).在顯色反應后，將培養(yǎng)板放置4°C冰箱內。(b).每孔加10μL 0.1M HCl溶液。(c).每孔加10μL 1% (w/v) 的SDS (十二烷基硫酸鈉)溶液。注意：反應停止后，應在24小時內測定。

11. 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。

12. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。