產(chǎn)品介紹

Cell Counting Kit-8簡(jiǎn)稱CCK-8試劑盒，是MTT，XTT等的替代方法，一種基于WST-8（水溶性四唑鹽，化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒。CCK-8溶液可以直接加入到細(xì)胞樣品中，不需要預(yù)配各種成分。WST-8在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的Formazan。對(duì)于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺(生成的Formazan量)和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系?？捎糜谒幬锖Y選、細(xì)胞增殖和毒性測(cè)定、腫瘤藥敏等試驗(yàn)。

操作步驟

一. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（測(cè)定細(xì)胞具體數(shù)量）

1.先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞；

2.按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做4-7個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每組3-6個(gè)復(fù)孔；

3.接種后培養(yǎng)2-4小時(shí)使細(xì)胞貼壁，然后加入CCK-8試劑（按每100 μL培養(yǎng)基加10μL CCK-8）培養(yǎng)一定時(shí)間后測(cè)定OD值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測(cè)定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量。（使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提條件是試驗(yàn)條件完全一致）

二. 細(xì)胞活性檢測(cè)

1.在96孔板中接種細(xì)胞懸液(100μL/孔)，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間；

2.向每孔加入10μL的CCK-8溶液(注意不要產(chǎn)生氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù))；

3.將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)；

4.用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。

三.細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)

1.在96孔板中接種細(xì)胞懸液(100μL/孔)，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)；

2.向培養(yǎng)板加入不同濃度的待測(cè)藥物；

3.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間；

4.向每孔加入10μL的CCK-8溶液(注意不要產(chǎn)生氣泡)；

5.將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)；

6.用酶標(biāo)儀測(cè)定在 450 nm 處的吸光度。 

注意：如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加 CCK-8 之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次， 然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。

四.活力計(jì)算

細(xì)胞存活率*（%）=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%

抑制率*（%）=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%

As:實(shí)驗(yàn)孔吸光度(含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液和藥物溶液)；

Ac: 對(duì)照孔吸光度 (含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，不含藥物) ；

Ab: 空白孔吸光度 (含培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，不含細(xì)胞、藥物) 。

保存條件

4℃避光保存，有效期12個(gè)月；-20℃避光保存，有效期24個(gè)月

實(shí)驗(yàn)應(yīng)用

1. 細(xì)胞增殖測(cè)定：CCK-8是水溶性的，在培養(yǎng)基中穩(wěn)定且無(wú)毒。

2. 細(xì)胞活性分析，包括細(xì)胞毒性：代謝活性以及染料的形成與細(xì)胞的活性和損傷成比例。

3. 細(xì)胞因子分析：測(cè)定細(xì)胞因子誘導(dǎo)的增殖，必要時(shí)，可在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)回收和擴(kuò)增細(xì)胞

注意事項(xiàng)

1.CCK-8的培養(yǎng)時(shí)間一般為1-4小時(shí)，但在培養(yǎng)30分鐘左右即可取出肉眼觀察顯色程度，根據(jù)細(xì)胞種類而定，需要摸索條件，CCK-8的最佳反應(yīng)時(shí)間以具體顯色的最佳時(shí)間為準(zhǔn)。

2.使用96孔板進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，一定要注意蒸發(fā)問(wèn) 題。一方面，由于96孔板周圍一圈最容易蒸發(fā)，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加相同量的PBS,水或培養(yǎng)液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方，以緩解蒸發(fā)。

3.本試劑盒的檢測(cè)依賴于脫氫酶催化的反應(yīng)，所以還原劑 (例如一些抗氧化劑)會(huì)干擾檢測(cè)，如果待檢測(cè)體系中存在較多的還原劑，需設(shè)法去除。用酶標(biāo)儀檢測(cè)前需確保每個(gè)孔內(nèi)沒(méi)有氣泡，否則會(huì)干擾測(cè)定。

4.加入藥物中如含有金屬，對(duì) CCK-8 顯色有影響。終濃度為1mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會(huì)抑制5%,15%,90% 的顯色反應(yīng)，使靈敏度降低。如果終濃度是10mM的話，將會(huì)100% 抑制。

5.培養(yǎng)基中的酚紅不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過(guò)扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成影響。

6.本產(chǎn)品可以檢測(cè)革蘭氏陰性細(xì)菌，但不能檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和酵母細(xì)胞。向100μL培養(yǎng)液中加入10μL CCK-8溶液，并培養(yǎng)1-4小時(shí)或過(guò)夜。

7.CCK-8試劑對(duì)細(xì)胞的毒性非常低。它和活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶持續(xù)反應(yīng)使溶液顏色不斷加深，OD值不斷增加(注: 活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶是持續(xù)產(chǎn)生的)。

8.要測(cè)定細(xì)胞的具體數(shù)量，建議同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

9.建議采用多通道移液器，以減小平行孔間的差異。

10.以下方法可以終止CCK-8反應(yīng)(96 孔板)：(a).在顯色反應(yīng)后，將培養(yǎng)板放置4°C冰箱內(nèi)。(b).每孔加10μL 0.1M HCl溶液。(c).每孔加10μL 1% (w/v) 的SDS (十二烷基硫酸鈉)溶液。注意：反應(yīng)停止后，應(yīng)在24小時(shí)內(nèi)測(cè)定。

11. 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。

12. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。